大腸菌の細胞質内で産生可能な代替抗体フラグメント形式の設計

Scientific Reports volume 13、記事番号: 14188 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

アクセシビリティと組織浸透性の向上により、抗体フラグメント (Fab) や一本鎖可変フラグメント (scFv) などのより小さな抗体フォーマットが、完全長抗体に対する効果的かつ低コストの選択肢としての可能性を示しています。 抗体のモジュール構造から派生したこれらのフォーマットは、特定の治療および診断用途にとってゲームチェンジャーとなる可能性があります。 微生物宿主は、抗体フラグメント形式の生産宿主として非常に有望であることが示されています。 しかし、タンパク質のフォールディングの複雑さと相まって、標的タンパク質の収量が低いため、生産に限界が生じます。 ここでは、Fab のフォールディングと生成に関連するいくつかの重要なボトルネックを克服するために設計された代替抗体フラグメント形式「FabH3」を報告します。 FabH3 分子は、静電ステアリング アプローチに基づいてヘテロ二量体化が可能な操作された免疫グロブリン G1 (IgG1) CH3 ドメインによって定常ドメインが置き換えられた Fab 形式に基づいています。 我々は、この代替抗体フラグメント形式が、触媒によるジスルフィド結合形成システム (CyDisCo) を使用して、ネイティブに折りたたまれた状態で大腸菌の細胞質内で効率的に産生され、Fab 対応物よりも高い可溶性収率と同等の結合親和性を備えていることを示します。標的抗原。

バイオ医薬品の中で、モノクローナル抗体 (Mab) セグメントは市場で支配的な地位を占めていますが、この傾向は新しい抗体形式や新薬の開発により徐々に変化しているようです1。 完全長モノクローナル抗体は循環半減期が長いため、特定の治療および診断用途には適さない可能性があります2。 潜在的な解決策として、抗体フラグメント (Fab) がバイオ医薬品業界の主要なプレーヤーとして浮上しています。 これらは、改善された深い腫瘍浸透、Mab がアクセスできない特定のエピトープへの結合、免疫原性が低下する可能性がある一価の抗原結合、より小さな抗体フラグメント形式よりも高い安定性、より迅速なクリアランスなど、特定の利点を提供します3、4、5。 抗体ベースの分子は、治療薬や診断薬として数多く応用されているため、その需要が増大し、さらに高収率での生産の必要性も高まっています。

承認されたバイオシミラーや「me-too」タイプの製品の多くは微生物発現系で生産されており、その宿主として大腸菌が引き続き選ばれています6。 Fab および scFv 抗体フラグメントはグリコシル化されておらず、比較的小さいため、大腸菌でのそれらの生産は、従来の哺乳類細胞培養システムよりも簡単で経済的に実行可能です。 抗体フラグメントは、ジスルフィド結合したタンパク質であり、伝統的に大腸菌の酸化性ペリプラズム内で、または還元性細胞質内の封入体として組換えによって生産されます。 しかし、どちらのアプローチも、これらの目的のタンパク質を効率的に生産するには重大なボトルネックを引き起こします。 Fab のペリプラズム発現では、主に非効率的なタンパク質移行とペリプラズムの体積が小さいためにタンパク質収率が低くなりますが、細胞質発現では、非天然状態のタンパク質分解や封入体への凝集という点で限界に直面しています。 市販されている 7 つの Fab のうち、2 つは封入体の形で大腸菌内で生成されます 3,7。 Fab のフォールディングは、ジスルフィド結合の形成、シス-トランス プロリル異性化、および制御されたオリゴマー化を含む複雑なプロセスであるため、封入体のリフォールディングは非効率的でコストがかかることがよくあります8。

Fab フラグメントは、共有結合した 2 つのポリペプチド鎖、つまり重鎖 (HC) と軽鎖 (LC) で構成され、それぞれ 2 つの定常ドメイン CH1 および CL と 2 つの抗原結合可変ドメイン VH および VL を含みます (図 1A)。 CH1 ドメインは、単独では本質的に無秩序なタンパク質であり、ジスルフィド結合の形成に関係なく、折りたたまれた状態を保ちます 9。 CH1 ドメインは CL ドメインとの相互作用でのみ典型的な免疫グロブリン (Ig) フォールディングを採用するため、抗体フラグメントのフォールディングにおける重要な律速段階の 1 つは定常ドメインの結合です 9,10。 さらに、HC の安定性が低く、共有結合および非共有結合した LC 二量体の形成と相まって、2 つの鎖の合成のバランスを取る必要があります 11、12。 最適な Fab 発現を実現するために、LC および HC の翻訳強度を変えて構築物を設計およびスクリーニングすることは、手間と費用がかかり、必ずしも成功するとは限りません。 Fab 分子の効率的なヘテロ二量体化を促進するためのアプローチがいくつかあります。たとえば、Ojima-Kato et al. は、定常ドメイン (Zipbody) へのロイシン - ジッパー ペプチド ペアの融合を報告しました 13。 ただし、タグ切断ステップの必要性とその後の免疫原性の問題により、Fab の治療への応用は制限されます。